液相色譜是一種廣泛使用且值得信賴的樣品分離方法，研究人員在目標(biāo)純化工作流程中使用該方法。分離的基礎(chǔ)涉及移動樣品（在溶液中）與固定相或固相的相互作用，所述固定相或固相將選擇性地捕獲，結(jié)合或與樣品中的組分相互作用。色譜法  利用核酸，小分子和大分子以及蛋白質(zhì)的多種化學(xué)和物理特性，從樣品混合物中選擇性地排除或捕獲目標(biāo)靶標(biāo)。

基本原則

在大多數(shù)情況下，液相色譜法涉及使用填充并保持在柱中的小顆?；驑渲ㄒ卜Q為介質(zhì)），也稱為固定相?？梢詫@些顆粒進(jìn)行物理或化學(xué)修飾，以提供在有時非常復(fù)雜的混合物中結(jié)合或排斥特定分子的特異性。這些色譜柱可以使用重力運(yùn)行以移動溶液樣品，但更常見的是它們在低，  中  或高壓下操作 - 通過機(jī)械泵和有時專用儀器來控制樣品流過色譜柱中的固定相。有多種色譜樹脂可用于滿足研究人員不斷變化的需求，以滿足不同的目標(biāo)分子的需求。

液相色譜可以在分析和制備規(guī)模上進(jìn)行。通過分析方法，目標(biāo)通常是從復(fù)雜混合物中發(fā)現(xiàn)，識別并有時量化組分。制備液相色譜的重點是分離和純化通常用于下游生物加工步驟的分子。

蛋白質(zhì)純化可能帶來一些挑戰(zhàn)，并且與任何純化方案一樣，需要協(xié)議優(yōu)化。對于培養(yǎng)基選擇有許多選擇，并且每種色譜方法用于不同的目的，無論是更一般的分子選擇還是高度特異性的分離。某些目標(biāo)可能需要使用不同的色譜柱進(jìn)行多個分離步驟，或采用多模式或混合樹脂方法來滿足研究人員的特定需求。

在這里，我們簡要討論一些用于蛋白質(zhì)純化工作流程的常見液相色譜方法，重點介紹每種方法的介質(zhì)（樹脂）和主要原理和注意事項。遵循的一般規(guī)則是以盡可能少的步驟獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)所需的純度。

色譜和媒體選擇

離子交換色譜
離子交換（IEX）色譜法根據(jù)分子的總電荷分離分子。該技術(shù)是一種功能強(qiáng)大的方法，可用于純化的分析階段和制備階段。離子交換樹脂通過將帶正電或帶負(fù)電的官能團(tuán)共價連接到固體基質(zhì)而產(chǎn)生。一些常用的基質(zhì)包括纖維素，瓊脂糖，聚甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯和聚丙烯酰胺。將蛋白質(zhì)樣品以低離子強(qiáng)度加載到IEX柱上，然后用增加離子強(qiáng)度/鹽的緩沖液洗滌以除去不需要的蛋白質(zhì)和雜質(zhì); 使用確定的鹽梯度或pH的變化洗脫目標(biāo)靶蛋白。通過鹽梯度洗脫依賴于帶電鹽離子與帶電樹脂的結(jié)合靶競爭的事實。具有較少帶電基團(tuán)的靶標(biāo)傾向于在較低鹽濃度下洗脫，具有較多帶電基團(tuán)的靶標(biāo)在較高鹽濃度下洗脫。緩沖條件對于該方法是關(guān)鍵的，并且樣品通常在低鹽條件下加載到柱上。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟。或者，通過pH洗脫利用靶蛋白的等電點（pI）。當(dāng)呈現(xiàn)給樣品的pH達(dá)到目標(biāo)靶的pI時，它不再帶有凈電荷并被樹脂釋放。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟。或者，通過pH洗脫利用靶蛋白的等電點（pI）。當(dāng)呈現(xiàn)給樣品的pH達(dá)到目標(biāo)靶的pI時，它不再帶有凈電荷并被樹脂釋放。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟?；蛘?，通過pH洗脫利用靶蛋白的等電點（pI）。當(dāng)呈現(xiàn)給樣品的pH達(dá)到目標(biāo)靶的pI時，它不再帶有凈電荷并被樹脂釋放。
對于諸如單克隆抗體的靶標(biāo)，IEX是有效的第二純化步驟; 親和色譜（見下文）通常是純化工作流程的初始步驟。對于非抗體分子，大珠IEX樹脂是**柱純化步驟的良好起點。

疏水相互作用色譜
疏水相互作用色譜（HIC）基于其疏水性分離蛋白質(zhì)。HIC通常用于分離或純化蛋白質(zhì)，同時保持其生物活性，因為該技術(shù)利用比其他純化方法對樣品變性更小的緩沖液，基質(zhì)和參數(shù)。鹽濃度，pH和溫度都可以影響與介質(zhì)的結(jié)合相互作用以及固定在樹脂上的配體化學(xué)。該方法是互補(bǔ)的，通常與上游高鹽IEX洗脫或下游大小排除（見下文）純化程序結(jié)合使用。

尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法（SEC）通過凝膠過濾基于其大小分配蛋白質(zhì)。凝膠由含有特定尺寸孔的球形珠組成，所述孔包括或排除來自介質(zhì)內(nèi)孔的分子。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)通過柱子時，蛋白質(zhì)的分離按大小發(fā)生，并按分子量降低的順序洗脫。**常用的兩種SEC方法是分餾和脫鹽/緩沖交換蛋白。SEC通常用于分離可能無法通過其他方法解析的蛋白質(zhì)，例如IEX或HIC。研究人員可以選擇保留SEC以進(jìn)行**后的純化步驟。

親和層析
親和層析利用固定在樹脂上的配體與其結(jié)合配偶體之間的特異性結(jié)合相互作用。結(jié)合/純化通常是高度選擇性的并且利用靶蛋白的生物結(jié)構(gòu)或功能。該方法的典型應(yīng)用包括抗體/抗原，酶/底物和酶/抑制劑相互作用。通過該方法可以純化天然以及重組產(chǎn)生的分子。除了提供更高的選擇性外，由于特定的相互作用，親和色譜可以提供更快的結(jié)果時間。根據(jù)具體的純度目標(biāo)，親和色譜通常是純化工作流程方案中的**步，如果不是**的步驟。

多模式或混合模式色譜
多峰或混合模式色譜法利用已經(jīng)用能夠多重相互作用的配體官能化的樹脂。當(dāng)純化不具有已知特異性的靶蛋白時，該方法是有用的。該樹脂可用于篩選，純化和潛在地鑒定靶蛋白上的位點，其可提供有用的親和力和選擇性信息。然而，由于存在多種結(jié)合和洗脫特性，因此不能通過簡單的氨基酸序列分析預(yù)測目標(biāo)相互作用，并且需要對結(jié)合和洗脫條件優(yōu)化進(jìn)行前期實驗。該技術(shù)的主要優(yōu)點是在單一介質(zhì)中結(jié)合互補(bǔ)色譜方法，可以節(jié)省純化步驟和珍貴的樣品材料，同時還可以提供更快的結(jié)果時間，

蛋白質(zhì)純化的許多選擇

從復(fù)雜樣品中分離目標(biāo)蛋白質(zhì)可能非常具有挑戰(zhàn)性。純化步驟是進(jìn)一步表征和理解靶蛋白功能的關(guān)鍵和必要過程。優(yōu)化工作流程過程涉及許多變量。通常，**好從目標(biāo)的一級氨基酸序列開始。這將提供有關(guān)分子量（作為SEC指南）和pI（作為IEX指南）的信息，并幫助預(yù)測和“評分”蛋白質(zhì)的溶解度特征。選擇合適的色譜介質(zhì)以及洗滌和洗脫緩沖液條件可以極大地幫助純化過程。當(dāng)目標(biāo)靶的性質(zhì)未被充分理解時，還存在多峰或混合模式樹脂。如需其他幫助，疏水性圖和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測也可以在考慮HIC或混合模式樹脂時提供指導(dǎo)。具有無序二級結(jié)構(gòu)的靶（特別是在末端）通常不穩(wěn)定或易于聚集，并且它們與HIC介質(zhì)良好相互作用。